實驗?zāi)康?/p>

　　麥角甾醇化學(xué)名為24β-甲基膽固醇-5，7烯-3β-羥基，分子式為C28H44O。麥角甾醇是微生物細(xì)胞膜的重要組成成分。抑制麥角甾醇的生物合成是目前殺菌劑的重要作用機(jī)制之一。真菌干菌絲中麥角甾醇含量一般維持在2～24mg/g之間，大部分在5mg/g左右。真菌細(xì)胞膜被一層厚實、堅韌并具有彈性的細(xì)胞壁包裹，對細(xì)胞起保護(hù)作用，必須將細(xì)胞壁破碎使胞內(nèi)物質(zhì)釋放才能進(jìn)一步提取。因此，禾谷鐮孢菌細(xì)胞破碎是檢測麥角甾醇含量的關(guān)鍵步驟。目前，真菌中主要采用的是皂化法、超聲波和微波3種方法進(jìn)行細(xì)胞破碎，其中，皂化法存在提取時間較長，溫度高，有機(jī)溶劑使用量大，安全系數(shù)小等缺陷;超聲波和微波提取盡管省時、節(jié)能、高效，但對于細(xì)胞壁較為堅硬的真菌細(xì)胞，破壁效率低，單獨(dú)使用難以達(dá)到理想的破壁效果。因此，本研究擬建立超聲輔助皂化法提取禾谷鐮孢菌麥角甾醇的方法，并利用HPLC進(jìn)行定量分析，為進(jìn)一步研究禾谷鐮孢菌的麥角甾醇奠定基礎(chǔ)。

實驗步驟

　　單因素試驗及響應(yīng)?優(yōu)化試驗 :單因素試驗:稱取禾谷鐮孢菌粉末，考察KOH含量(0.01，0.015，0.02，0.025，0.03和0.04g/mL)、超聲提取溫度(20℃，30℃，40℃，50℃和60℃)、液固比(20，40，100，200和400mL/g)及超聲提取時間(5，10，15，20和30min)對禾谷鐮孢菌麥角甾醇提取量的影響。響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，在單因素試驗基礎(chǔ)上，以麥角甾醇提取量為響應(yīng)值，乙醇中堿含量、提取溫度、液固比和超聲提取時間為自變量進(jìn)行提取條件優(yōu)化。

實驗結(jié)果

　　皂化過程中可通過堿來解離結(jié)合的麥角甾醇，試驗采用乙醇提取麥角甾醇，因此乙醇中堿含量對于麥角甾醇的提取十分重要。通過單因素試驗提取麥角甾醇結(jié)果見圖1。如圖1(A)所示，當(dāng)堿含量約為0.03g/mL，皂化效果較好。植物原料中皂化溫度越高，麥角甾醇的皂化效率越高，一般情況下，皂化溫度越高，皂化程度越劇烈，超聲加速細(xì)胞壁破壁，溶解，更有利于皂化反應(yīng)的進(jìn)行，通常在70℃可完全皂化。圖1(B)所示超聲輔助后，在40℃麥角甾醇提取量即可達(dá)到平衡，說明超聲輔助皂化可以顯著降低皂化溫度，降低皂化能耗。圖1(C-D)所示，當(dāng)液固比和超聲提取時間增加時，禾谷鐮刀菌中麥角甾醇的提取量呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢;在液固萃取時，液固比不同，液相、固相之間的濃度差就不同，傳質(zhì)推動力就會出現(xiàn)快慢，影響提取效果。超聲提取時間的增加會增加細(xì)胞破碎程度，使得麥角甾醇更易于發(fā)生皂化反應(yīng)，皂化反應(yīng)完成后，超聲可能會破壞麥角甾醇結(jié)構(gòu)，致使其含量下降。因此綜合考慮提取量、效率、成本等各項因素，選擇KOH含量0.03g/mL、溫度40℃、液固比200mL/g、超聲時間15min為中心點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗。

圖1各因素對??甾醇提取量的影響

實驗討論

　　采用超聲輔助皂化法提取麥角甾醇，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化，對影響麥角甾醇提取效果的主要因素進(jìn)行研究，并建立禾谷鐮孢菌菌絲中麥角甾醇的提取方法。結(jié)果表明，各因素對麥角甾醇提取量的影響程度依次為:堿含量>液固比>時間>溫度。最佳提取條件為堿含量為0.034g/mL、溫度為36℃、液固比為200mL/g、超聲提取時間8min，在該提取條件下，麥角甾醇提取量高達(dá)0.88mg/g。該方法線性范圍為3.125～200μg/mL，回收率達(dá)到82%以上，以其作為小麥禾谷鐮孢菌固態(tài)發(fā)酵生物量的指標(biāo)，可信度高，也可被借鑒于其他真菌的相關(guān)研究和應(yīng)用中。

[1]郭瑞,饒斌,吳琴燕,等.超聲輔助皂化提取禾谷鐮孢菌中麥角甾醇及其HPLC分析[J].分析試驗室,2019,38(11):1353-1358.DOI:10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2019.022006.